顯微高光譜成像系統(tǒng)在臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)、微電子學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。很多用戶這種設(shè)備也比較好奇，本文簡(jiǎn)單介紹了顯微高光譜成像系統(tǒng)的成像原理和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。

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顯微高光譜成像系統(tǒng)的成像原理

顯微高光譜成像實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)基于推帚式成像光譜儀的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，光路原理圖如圖所示。

處于顯微鏡載物臺(tái)上的樣品被柯勒照明系統(tǒng)照明，瞬時(shí)視場(chǎng)內(nèi)的樣品條帶通過顯微鏡物鏡和0.6倍CMount接口鏡頭成像于分光計(jì)的狹縫處，再經(jīng)過光譜分光組件后，在垂直樣品條帶方向按光譜色散，最后成像于CCD像面。

CCD光敏面平行于狹縫的一維稱為空間維，垂直于狹縫的一維稱為光譜維，空間維每一行光敏元上得到的是樣品條帶一個(gè)光譜波段的像，這樣面陣CCD相機(jī)每幀圖像便對(duì)應(yīng)于一個(gè)樣品條帶的多光譜圖像。通過載物臺(tái)自動(dòng)裝置對(duì)樣品進(jìn)行推掃，就得到整個(gè)樣品的二維圖像及光譜數(shù)據(jù)，即圖像立方體。

整個(gè)系統(tǒng)由顯微鏡、分光計(jì)、面陣CCD相機(jī)、載物臺(tái)自動(dòng)裝置以及數(shù)據(jù)采集與控制模塊等幾部分組成。系統(tǒng)的光譜范圍從400nm到800nm，120個(gè)波段，光譜分辨率優(yōu)于5nm，空間分辨率大約1μm。不僅能夠提供微小物體在可見光范圍的單波段顯微圖像，而且能夠獲得圖像中任一像素的光譜曲線，實(shí)現(xiàn)了光譜技術(shù)和顯微成像技術(shù)的結(jié)合，在微觀領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

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顯微高光譜成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

1.?總體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

由于顯微鏡是帶有光源的主動(dòng)光學(xué)系統(tǒng)，因此，為了獲得成像光譜，從總體上考慮，有兩種系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可供選擇：

一種是在前光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行光譜分光，即采用波長(zhǎng)調(diào)諧的照明光源，照明光源以一定的波長(zhǎng)間隔連續(xù)或非連續(xù)地掃描，在每一個(gè)預(yù)定的波長(zhǎng)處得到一個(gè)灰度圖像，波長(zhǎng)掃描后便構(gòu)成光譜圖像立方體。這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是不用在成像光路中插入任何光學(xué)和機(jī)械元件，因而不會(huì)增加額外的光學(xué)像差。缺點(diǎn)是很費(fèi)時(shí)，對(duì)于上百個(gè)波段的高光譜成像而言，往往需要長(zhǎng)達(dá)小時(shí)量級(jí)的時(shí)間。而且，這種方法不適用于熒光應(yīng)用，因?yàn)橐玫綗晒庑枰ぐl(fā)光源。

另一種結(jié)構(gòu)是在后光學(xué)系統(tǒng)（即成像光束）中進(jìn)行光譜分光，這是用于航空航天遙感領(lǐng)域的光譜成像儀中廣泛采用的方法，對(duì)于顯微高光譜成像系統(tǒng)，這種方案也可以借鑒。

因此，本顯微高光譜成像實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)采用后一種結(jié)構(gòu)形式，即在成像光束中進(jìn)行光譜分光。利用推帚式光譜成像儀的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，將光譜儀子系統(tǒng)光學(xué)耦合到生物顯微鏡的三目鏡筒上；利用高精度步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)進(jìn)行微米級(jí)平動(dòng)，實(shí)現(xiàn)推帚成像。

整個(gè)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上主要由顯微鏡、分光計(jì)、CCD相機(jī)、數(shù)據(jù)采集和控制系統(tǒng)幾部分組成。

2.?分光子系統(tǒng)設(shè)計(jì)

目前，用于成像光譜儀器的光譜分光方法主要有棱鏡分光、光柵分光、傅里葉變換、聲光可調(diào)諧濾光片、液晶可調(diào)諧濾光片、漸變?yōu)V光片、二元光學(xué)元件等方法。從目前的應(yīng)用情況來看，光柵分光仍是應(yīng)用廣泛而且技術(shù)相對(duì)成熟的光譜分光方法。因此，本系統(tǒng)仍采用傳統(tǒng)的光柵分光方法。而對(duì)于光柵而言，又可分為反射光柵和透射光柵。由于該系統(tǒng)屬于直視系統(tǒng)，即同軸光學(xué)系統(tǒng)，因此，若采用反射光柵，將使系統(tǒng)的光軸發(fā)生折轉(zhuǎn)，從而給系統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)帶來困難。為簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)，本系統(tǒng)采用透射光柵分光。

對(duì)于透射光柵，根據(jù)光柵方程，當(dāng)垂直光柵入射，即入射角為零時(shí)，若取+1級(jí)或-1級(jí)衍射光譜，則衍射角不為零，即所有衍射光線將沿系統(tǒng)主光軸發(fā)生偏轉(zhuǎn)，從而造成整個(gè)系統(tǒng)為非同軸系統(tǒng)。因此，為了使整個(gè)系統(tǒng)保持為同軸光學(xué)系統(tǒng)，采用棱鏡-光-棱鏡組合的分光方式，使分光后中心波長(zhǎng)的衍射光線沿系統(tǒng)主光軸衍射。光譜分光系統(tǒng)的主要設(shè)計(jì)參數(shù)如下：

狹縫：寬度25um，有效長(zhǎng)度8.8mm；準(zhǔn)直光學(xué)鏡頭：f=40mm，f/2.8；會(huì)聚光學(xué)鏡頭：f=40mm，f/2.8，與準(zhǔn)直光學(xué)鏡頭為對(duì)稱式結(jié)構(gòu)；光柵頻率：3151/mm；前棱鏡：頂角11.8?，上寬度2.4mm，下寬度5.8mm，中心厚度4.1mm；后棱鏡：頂角11.2?，上寬度1.0mm，下寬度5.5mm，中心厚度3.2mm。

3.?載物臺(tái)自動(dòng)裝置設(shè)計(jì)

根據(jù)推帚式成像光譜儀的特點(diǎn)，系統(tǒng)使用狹縫作為視場(chǎng)光闌，對(duì)瞬時(shí)視場(chǎng)內(nèi)的

觀測(cè)目標(biāo)進(jìn)行一維采樣，因此，要獲得整個(gè)觀測(cè)目標(biāo)的二維圖像，必須對(duì)另一維進(jìn)行推帚。用于航空遙感的推帚式成像光譜儀是借助飛機(jī)的向前運(yùn)動(dòng)來完成推帚的，與之不同的是，顯微高光譜成像系統(tǒng)是利用載物臺(tái)的平動(dòng)來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的推帚成像，因此該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)需要設(shè)計(jì)和研制載物臺(tái)自動(dòng)裝置。為了獲得準(zhǔn)確的光譜圖像，必須對(duì)載物臺(tái)的運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行精確的控制。本系統(tǒng)利用步進(jìn)電機(jī)連接滾珠絲杠，將滾珠絲杠的移動(dòng)橫梁連接到載物臺(tái)，來驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)運(yùn)動(dòng)。因此，載物臺(tái)的運(yùn)動(dòng)速度是通過對(duì)步進(jìn)電機(jī)的轉(zhuǎn)速控制來實(shí)現(xiàn)的。而步進(jìn)電機(jī)的轉(zhuǎn)速控制是通過單片機(jī)產(chǎn)生方波脈沖信號(hào)來觸發(fā)步進(jìn)電機(jī)進(jìn)行步進(jìn)旋轉(zhuǎn)。因此，單片機(jī)產(chǎn)生的方波脈沖信號(hào)頻率最終決定了載物臺(tái)的運(yùn)動(dòng)速度。

系統(tǒng)的瞬時(shí)視場(chǎng)與系統(tǒng)的總放大倍數(shù)和CCD光譜維像元尺寸有關(guān)。在該系統(tǒng)中，CCD光譜維像元大小為27um，當(dāng)使用40倍物鏡時(shí)，系統(tǒng)的總放大倍數(shù)為40?.6=24倍。因此，系統(tǒng)在光譜維方向的空間分辨率為27/24=1.125um，而相機(jī)的幀速率為30幀/秒，所以，載物臺(tái)的運(yùn)動(dòng)速度為1.125?0=33.75um/s。由于絲杠的螺紋間距為1mm，即1000um，步進(jìn)電機(jī)的每轉(zhuǎn)步數(shù)為10000步/轉(zhuǎn)，因此，步進(jìn)電機(jī)每旋轉(zhuǎn)一步對(duì)應(yīng)載物臺(tái)的前進(jìn)距離為1000/10000=0.1um，最后計(jì)算出電機(jī)的運(yùn)行頻率為33.75/0.1=337.5Hz，即需要產(chǎn)生的方波脈沖的周期為2963μs。

4.?數(shù)據(jù)采集子系統(tǒng)

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)主要包括高光譜結(jié)果數(shù)據(jù)傳輸、采集、控制、存儲(chǔ)和實(shí)時(shí)顯示等功能，由于高光譜成像系統(tǒng)的數(shù)據(jù)傳輸速率非常高，因此傳統(tǒng)的基于ISA、EISA總線的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)已不能滿足要求。而PCI總線的最大數(shù)據(jù)傳輸速率為132

MB/s，能滿足高光譜成像系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集的要求。所以，本系統(tǒng)采用PCI總線作為數(shù)據(jù)采集的微機(jī)接口。

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計(jì)方法，將各個(gè)主要功能模塊分離開來，模塊間采用統(tǒng)一的接口進(jìn)行通信；并且在數(shù)字邏輯實(shí)現(xiàn)上，采用在系統(tǒng)可編程（In System Program）器件，通過軟件對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行配置，提高系統(tǒng)的靈活性。其具體設(shè)計(jì)方法與其他高光譜成像儀器的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)類似。

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